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Este ejemplo ilustra la preparación de Kinobeads con 4 ligandos diferentes. Los ligandos de captura de amplio espectro se inmovilizaron covalentemente en un soporte sólido por enlace covalente usando grupos funcionales adecuados por ejemplo grupos amino o carboxilo.

Los compuestos que no contienen un grupo funcional adecuado se modificaron con el fin de introducir un grupo tal. Ligando de Kinobeads 3: CZC; 7- diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 2,6-diclorofenil metil-1H-[1,6]naftiridinona.

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Síntesis de ligando de Kinobeads 4-aminometil-fenilamino 2,6-diclorofenil metil-1H-[1,6]naftiridinona. Las etapas que quedan se llevaron a cabo como se describe a continuación. Etapas 6- 2,6-diclorofenil metanosulfonilmetil-8H-pirido[2,3-d]pirimidinona se sintetizó a partir de éster de 4-clorometilsulfanilpirimidinacarboxilato de etilo siguiendo el procedimiento en J.

La mezcla de reacción en bruto se disolvió en diclorometano y se lavó con HCl 2 N ac. Etapa 9: 7- 4-aminometil-fenilamino 2,6-dicloro-fenil metil-1H-[1,6]naftiridinona.

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Se retiró el disolvente al vacío. El residuo se disolvió en agua y la solución se basificó en carbonato de sodio sat. El precipitado resultante se recogió y se secó proporcionando 7- 4-aminometil-fenilamino 2,6-dicloro-fenil metil-1H-[1,6]naftiridinona.

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Ligando de Kinobeads 4: CZC Fórmula química C17H16N5F. Síntesis de CZC 2- 4'-aminometilfenilamina fluoro-pirimidinil -fenil-amina.

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La mezcla acuosa se extrajo con éter dietílico 3 x 10 ml. El diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 se retiró por evaporación a A una solución de 2,4-diclorofluoro-pirimidina 0, g, 3,30 mmol en dimetilformamida 13 ml se añadió anilina 0, ml, 3,30 mmol y N-etildiisopropilamina 0, ml, 3,63 mmol y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas.

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Se mezclaron conjuntamente 2-clorofluoro-pirimidinil -fenilamina 0, g, 0,39 mmol y 4[N-Boc-aminometil]anilina 0,g, 0,39 mmol. Se retiró el disolvente por evaporación.

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Se añadió agua 5 ml y el pH de la solución se elevó a 8 por adición de bicarbonato de sodio. Todas las reacciones se llevaron a cabo en atmósfera inerte. Se obtuvieron espectros de RMN en un dpx de Bruker. Las longitudes de onda fueron de y nm. A continuación se describen los procedimientos.

Las perlas se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad en un agitador de extremo a extremo Roto Shake Genie, Scientific Industries Inc. La eficacia de acoplamiento se determinó por HPLC. Los grupos NHS no reaccionados se bloquearon en.

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Se almacenaron perlas lavadas en isopropanol o se usaron inmediatamente para reacciones de unión. Elaborar una mezcla de proporción de aminoetanol y etilendiamina, después añadir trietilamina a la mezcla.

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Acoplamiento de PyProB. Este procedimiento no requiere una etapa de preactivación, la activación y el acoplamiento tienen lugar in situ.

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Etapas de centrífuga: 1 minuto a rpm a temperatura ambiente. Este ejemplo ilustra el tratamiento de células con compuestos véase particularmente el segundo aspecto de la invención. Las células HeLa se trataron con factor de crecimiento epidérmico EGFse preparó un lisado celular y se analizó diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 Kinobeads protocolo experimental en sección 2. La preparación de Kinobeads se describe en el Ejemplo 1.

En paralelo el lisado celular se sometió a inmunoprecipitación con un anticuerpo anti-fosfotirosina protocolo experimental en sección 2. Cultivo celular. Propagación celular.

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Después de que las células han alcanzado confluencia en una placa de 15 cm, las células se dividieron 1 a 10 para crecimiento adicional. Las células se dividieron retirando primero los medios sobrenadantes, lavando después brevemente las células con diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 ml de tampón de PBS Gibco, Después del desprendimiento de las células, se añadieron 8 ml de medio de cultivo MEM véase anteriormente por placa de 15 cm.

Se puso 1 ml de esta solución en placas de 15 cm recién preparadas y se añadieron medios de MEM de 24 ml véase anteriormente.

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Tratamiento con EGF de células. Recogida de células. El sobrenadante se aspiró y el sedimento de células se resuspendió en diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 ml de tampón de PBS enfriado en hielo. Preparación de soluciones de reserva usadas en este protocolo: Preparación de una solución de reserva de Na3VO4 mM:. El pH de partida de la solución de ortovanadato de sodio puede variar con lote.

Las alícuotas pueden almacenarse durante varios meses. Disolver 21,0 g de NaF Sigma, S en ml de agua destilada. Añadir agua destilada hasta g.

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Mezclar completamente y almacenar solución a temperatura ambiente. Las Kinobeads ligandos capturadores inmovilizados se pusieron en contacto con el lisado celular preparado a partir de células HeLa en condiciones que permiten la unión de las proteínas en el lisado a los ligandos.

Las condiciones de unión estaban cerca de las fisiológicas eligiendo condiciones tampón adecuadas que conservan la función de las proteínas. Después de retirar proteínas no capturadas a través de un procedimiento de lavado suave diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 proteínas unidas se pusieron en contacto con un compuesto de prueba que condujo a la elución de las proteínas.

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Todos los tampones contienen concentración final de DTT 1 mM. Las Kinobeads Ejemplo 1 se prepararon para la reacción de unión lavando con un tampón adecuado y por equilibrio en el tampón. Se llevaron a cabo las siguientes link. Las perlas lavadas y equilibradas de la sección 2.

Se retiraron proteínas no específicamente unidas por lavado suave con el fin de reducir la unión precedente.

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Las perlas antifosfotirosina se prepararon para la reacción de unión lavando con un tampón adecuado diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 por equilibrio en un tampón. El lisado celular se preparó para la reacción de unión por dilución en un tampón adecuado y limpiando por medio de una etapa de centrifugación. Las perlas antifosfotirosina lavadas y equilibradas se pusieron en contacto con el lisado celular diluido de la sección. La digestión tríptica de una mezcla de proteína separada de SDS-PAGE genera para cada proteína numerosos fragmentos peptídicos distintos con diferentes propiedades fisicoquímicas.

Para cada entrada de proteína de base de datos IPI con al menos 10 identificaciones inequívocas en el conjunto de datos CZ ID de multipéptidos o ID de péptidos individuales verificados manualmentese calculan las frecuencias péptídicas para los diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 que contribuyen.

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Las proteínas se identificaron correlacionando la masa de péptidos medida y los datos de fragmentación con los mismos datos computados a partir de las entradas en la base de datos usando la.

Los resultados del experimento de Signaloquinoma se muestran en la Figura 2. En el experimento de Kinobeads se identificaron un total de proteínas, de estas eran cinasas.

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Diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 para la identificación de compuestos novedosos que interaccionan con enzimas. La presente invención se refiere a procedimientos para la caracterización de enzimas usando ligandos de enzimas unidos a soportes sólidos.

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De los enzimas, son de interés particular por ejemplo proteasas, fosfodiesterasas y cinasas revisión: Drews,"Drug discovery: a historical perspective", Science El inhibidor de PDE5 sildenafil Viagra proporciona un tratamiento efectivo para la disfunción eréctil. Un desafío mayor en este campo es el desarrollo de inhibidores específicos de isotipo PDE con el fin de evitar reactividad cruzada que es responsable de efectos secundarios Card y cols.

El complemento de proteína cinasas codificadas en el genoma humano comprende miembros de familia quinoma que pueden agruparse en varias subfamilias de acuerdo con diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 similitud de secuencias revisión: Manning y cols. En cualquier célula o tejido dado solo se expresa un subgrupo de quinoma.

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Las diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 transfieren grupos fosfato desde ATP hasta moléculas sustrato e influencian por lo tanto la estabilidad, la actividad y la función de sus dianas. El bolsillo de unión a ATP de diferentes cinasas es estructuralmente similar y por lo tanto se considera difícil desarrollar inhibidores competitivos de ATP selectivos.

Nature Reviews Drug Discovery, volumen 1, Otra clase de cinasas de interés son las cinasas diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 lípidos. Las diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 de lípidos catalizan la transferencia de grupos gamma-fosfatos a partir de nucleósido trifosfatos a sustratos lipídicos.

Phosphoinositide kinases. Annual Review Biochemistry 67, ; Cantley, L. Un prerrequisto para la identificación de compuestos que interaccionan con proteínas, por ejemplo enzimas, es la provisión de preparaciones de proteínas que contienen tantas proteínas como sea posible de una clase en see more gran pureza. Especialmente, la provisión de muchas proteínas de una clase por ejemplo cinasas es importante dado que esto permite el rastreo de compuestos potencialmente interesantes farmacéuticamente contra muchos miembros de la.

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Otros usos factibles de tales preparaciones de proteínas incluyen la realización de pruebas de compuestos químicamente optimizados optimización de compuestosla determinación de la selectividad de un compuesto dado revelación del visit web page completo de selectividad así como la confirmación del modo de acción diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 un compuesto dado.

Una aproximación para enriquecer las proteínas de unión a ATP tales como cinasas y otras proteínas de unión a nucleótidos a partir de extractos celulares se basa en ATP inmovilizado diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 reactivo de afinidad, es decir en el uso de un ligando que une potencialmente todas las enzimas de unión a ATP.

El rastreo intensivo de una biblioteca de química combinatoria de purinas 2,6,9-trisustituidas ha conducido a la identificación de un inhibidor de CDK potente y selectivo llamado purvalanol Knockaert y cols. Aquí, los extractos celulares se rastrearon en busca de proteínas que interactuasen con purlavanol por cromatografía de afinidad en presencia de compuestos inmovilizados.

Otra estrategia es la expresión in vitro de enzimas de una clase dada, por ejemplo cinasas. Fabian y colegas Fabian y cols. Las cinasas o dominios de cinasas usadas en este ensayo son proteínas de fusión que se marcan con el fin de permitir expresión, purificación y detección.

Otra aproximación usa sondas dirigidas a sitio activo así llamadas sondas basadas en actividad que forman enlaces covalentes con enzimas diana.

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Este procedimiento se usa para realizar un perfil de la expresión de serina hidrolasas con sondas altamente selectivas Liu y cols. Otra limitación es la dificultad para distinguir interacciones específicas con enzimas e interacciones no específicas causadas por la reactividad intrínseca de las sondas. Finalmente, se intentó enriquecer las proteínas biofosforiladas en tirosinas con anticuerpos específicos de tirosina Blogoev y cols.

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Blogoev y diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 describen un procedimiento que se puede usar para estudiar el efecto de compuestos tales como factor de crecimiento epidérmico EGF en rutas de transducción de señales dependientes de fosfotirosina. Un limitación principal de esta aproximación es que solamente pueden capturarse proteínas fosforiladas con tirosina. En vista de esto, hay una necesidad de procedimientos mejorados para la diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 de aquellas enzimas de una clase dada que se expresan en una célula.

La presente invención satisface estas necesidades. En el contexto de la presente invención, se ha encontrado sorprendentemente que el uso de un ligando de enzima de amplio espectro inmovilizada en un soporte sólido permite el aislamiento efectivo de enzimas fuera de una preparación proteica, preferentemente un lisado celular.

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La enzima se identifica preferentemente por espectrometría de masas. Por lo tanto, la presente invención proporciona procedimientos efectivos bien diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 la caracterización de las enzimas o bien para la identificación de los compañeros de unión de un compuesto dado. En un primer aspecto, la presente invención describe un procedimiento para la caracterización de al menos una enzima, que comprende las etapas de:.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la caracterización de al menos una enzima, que comprende las etapas de:. De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, la invención proporciona un procedimiento para la caracterización de al menos una enzima, que comprende las etapas de:.

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De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención, se describe un procedimiento para la caracterización de un complejo compuesto-enzima, que comprende las etapas de:.

La unión competitiva o la elución competitiva son posibles con cualquier compuesto de interés no modificado, no inmovilizado. A lo largo de la invención, el término "enzima" incluye también cada proteína o péptido en diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 célula que es capaz de unir un ligando tal como vehículos, canales iónicos y proteínas que interaccionan con enzimas tales como proteínas adaptadoras, que contienen dominios de interacción peptídica por ejemplo dominios SH2, SH3 y PDZ.

Preferentemente, sin embargo, el término "enzima" se interpreta en su modo usual como que es un biocatalizador en una célula. Los ejemplos incluyen una mezcla líquida de varias proteínas, un lisado celular parcial que no contiene todas las proteínas presentes en la célula original o una combinación de diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 lisados celulares.

Coligan, Ben M.

Procedimiento para la identificación de compuestos novedosos que interaccionan con enzimas.

Dunn, Hidde L. Ploegh, David W.

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Speicher, Paul T. A lo largo de la invención, el término "soporte sólido" se refiere a cada soporte insoluble que es capaz de inmovilizar.

El procedimiento de la invención de acuerdo con el segundo aspecto comprende las etapas de una provisión de dos alícuotas comprendiendo cada una al menos una célula que contiene la enzima e incubando una alícuota con un compuesto dado. En una realización preferida, la al menos una célula es parte del sistema de cultivos celulares que se divide en al menos dos alícuotas.

Una alícuota de células se incuba también con el compuesto dado. Se conocen en la técnica procedimientos para la incubación de sistemas de cultivo celular con compuestos Giuliano y cols. Journal of Diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 Screening 9 7 Sin embargo, se incluye también dentro de la presente invención que al menos una célula de cada alícuota es parte de un sistema in vivo, por ejemplo un sistema de ratón o un sistema see more vertebrado inferior.

Por ejemplo se pueden usar los lisados de embriones diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 derivados de fases de desarrollo definidas o de diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 adultas de organismos modelo tales como C.

Todos los procedimientos de la presente invención incluyen al menos en una realización preferida las etapas de recoger al menos una célula que contiene la enzima y de lisar la célula. En una realización preferida, la célula es parte de un sistema de cultivo celular y los procedimientos para la recogida de una célula aparte de un sistema de cultivo celular se conocen en la técnica bibliografía supra.

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Los procedimientos correspondientes se conocen en la técnica. Diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 ejemplo, una biopsia es un procedimiento diagnóstico usado para obtener una cantidad pequeña de click here, que puede examinarse después microscópicamente o con procedimientos bioquímicos. Los procedimientos de la invención descritos permiten realizar un perfil de las muestras de tejido para la presencia de las clases de enzimas.

Por ejemplo, las enzimas mutadas causantes de la enfermedad se pueden identificar por ejemplo mutaciones puntuales que activan cinasas oncogénicas. Sin embargo, se prefiere igualmente que la célula se recoja primero y se lise aparte después. El contacto en condiciones fisiológicas esenciales tiene la ventaja de que las interacciones entre el ligando, la preparación celular es decir la enzima a caracterizarse y opcionalmente el compuesto reflejan tanto como es posible las condiciones naturales.

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Incluyen la concentración de proteínas fisiológica, el pH, la concentración salina, la capacidad tamponante y las modificaciones postraduccionales de las proteínas implicadas. El término "condiciones fisiológicas esenciales" no requiere condiciones idénticas a aquellas en el organismo vivo original, a partir del que se deriva la muestra, sino esencialmente condiciones similares a las de las células o condiciones cercanas a las condiciones celulares.

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Por ejemplo, la disrupción eventualmente necesaria de las paredes celulares o de diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 membranas celulares cuando se toma y se procesa una muestra a partir de un organismo vivo requiere condiciones que no son idénticas a las condiciones fisiológicas halladas en el organismo.

Esto incluye la posibilidad de tener el soporte sólido en una fase inmovilizada y de verter el lisado en ella.

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En diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 realización preferida, se incluye también que el soporte sólido esté en una forma particulada y se mezcle con el lisado celular. En una realización preferida, la unión entre ligando y enzima es una unión no covalente, reversible, por ejemplo por medio de puentes salinos, enlaces de hidrógeno, interacciones hidrófobas o una combinación de los mismos.

Adicionalmente, los procedimientos de la invención incluyen la etapa de eluir la enzima o enzimas a partir de los ligandos inmovilizados en el soporte sólido. Principalmente, cambiar la fuerza iónica, el valor de pH, la temperatura o incubación con detergentes son procedimientos adecuados para disociar las enzimas objetivo a partir del ligando inmovilizado.

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La aplicación de un tampón de elución puede disociar compañeros de unión por extremos de valor de pH pH alto o bajo; por ejemplo bajando pH usando citrato 0,1 M, pHcambio de fuerza iónica por ejemplo concentración salina alta diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 NaI, KI, MgCl2, o KClagentes reductores de polaridad que alteran interacciones hidrófobas por ejemplo dioxano o etilenglicolo agentes desnaturalizantes sales caotrópicas o detergentes caotrópicos tales como dodecilsulfato de sodio, SDS; revisión: Subramanian A.

Esta puesta en contacto tiene lugar también preferentemente en condiciones esencialmente fisiológicas.

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Una ventaja de usar un compuesto de interés para elución en vez de los reactivos no específicos descritos anteriormente es que no todas las proteínas unidas se liberan sino solamente una subfracción, preferentemente la clase de enzimas de interés. Tal lavado es parte del conocimiento de la persona experta en la técnica. El lavado sirve para retirar componentes no unidos del lisado celular del soporte diagnosticado con diabetes a las 22x7-10.

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Se pueden minimizar interacciones de unión no específicas por ejemplo iónicas simples añadiendo niveles bajos de detergente o por ajustes moderados a concentraciones salinas en el tampón de lavado. Después de la elución o puesta en contacto, en algunos casos el soporte sólido tiene preferentemente que separarse del material diagnosticado con diabetes a las 22x7-10. Los procedimientos individuales para esto click de la naturaleza del soporte sólido y se conocen en la técnica.

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En caso de que el material de soporte se mezcle con los componentes del lisado así llamado diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 en régimen here puede ser necesaria una etapa de separación adicional tal como centrifugación suave y el material liberado se recoge como sobrenadante.

Alternativamente se pueden usar perlas magnéticas como soporte sólido de tal forma que las perlas se puedan eliminar de la muestra usando un dispositivo magnético. Alternativamente, a lo largo de la invención también es posible llevar a cabo esta caracterización con anticuerpos específicos dirigidos contra la enzima respectiva o contra el compañero de unión coeluido.

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Cuarta Edición, editado por F. Ausubel y cols. Methods and Protocols. Editor: David M. Humana Press, Totowa, EE. Diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 ensayos pueden configurarse no solamente en cierto modo para detectar y cuantificar una enzima de interés, sino también para analizar patrones de modificación postraduccional tales como fosforilación. Por ejemplo, el estado de activación de una cinasa se puede determinar probando su estado de fosforilación con anticuerpos anti-fosfotirosina, anti-fosfoserina o anti-fosfotreonina específicos.

Se conoce en la técnica como seleccionar y usar tales antifosfo-anticuerpos Zhang y cols.

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Por lo tanto, por administración del compuesto, bien se puede cambiar la expresión de la enzima o bien se puede cambiar el estado diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 activación de la enzima.

Ello puede significar también que la afinidad de la enzima click el ligando inmovilizado se incrementa o decrece por ejemplo cambio del estado de activación de una cinasa por fosforilación por medio de una cinasa corriente arriba; diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 unión del compuesto a un extremo regulador alostérico de la enzima y de este modo alteración del bolsillo de unión a ATP de una enzima de unión a ATP.

En el procedimiento de acuerdo con el primer aspecto, la preparación proteica se incuba, preferentemente en.

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De acuerdo con una realización preferida del procedimiento de acuerdo con el tercer aspecto de la invención, en la etapa c la alícuota se pone en contacto, preferentemente en condiciones esencialmente fisiológicas, con el compuesto antes de la incubación con el ligando.

En una realización preferida del procedimiento de la invención de acuerdo con el tercer aspecto, una detección reducida de click here enzima en la alícuota incubada con el compuesto indica que la enzima es un objetivo directo del compuesto.

Esto resulta del hecho de que en la etapa c de este procedimiento de la invención, el compuesto compite con el ligando para la unión de la enzima. Si se puede detectar menos enzima en diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 alícuota incubada con el diagnosticado con diabetes a las 22x7-10, esto quiere decir preferentemente que el compuesto ha competido con el inhibidor para la interacción con la enzima y es, por lo tanto, un objetivo directo de la enzima y viceversa.

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En el procedimiento de acuerdo con el cuarto aspecto, se prefiere que este procedimiento se lleve a cabo como diagnosticado con diabetes a las 22x7-10 rastreo de rendimiento medio o alto. Tales ensayos se conocen por la persona experta en la técnica Mallari y cols. Principalmente, de acuerdo con la presente invención, un compuesto tal puede ser cada molécula que sea capaz de interaccionar con las enzimas. Pulseras de alerta médica para diabetes gratis.

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